Informace o publikaci
Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2002 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Klíčová slova | Pseudoazurin Kinetics Paracoccus enzyme denitrification |
| Popis | Klíčovým krokem denitrifikace je konverze iontového dusitanu na plynný oxid dusnatý. U bakterie Paracoccus denitrificans ji katalyzuje enzym nitritreduktasa, typu cytochromu cd1. Nitritreduktasa však neinteraguje s membránovými komponentami přímo, ale vyžaduje přítomnost proteinového mediátoru, cytochromu c550, nebo pseudoazurinu (1). Vzhledem k vysoké koncentraci nitritreduktasy byl tento protein izolován z přirozeného zdroje Paracoccus denitroficans. Naproti tomu pseudoazurin se jak u mutantního kmene deficientního v cytochromu c550, tak i u divokého kmene vyskytuje ve velmi nízké koncentraci. Proto byla v případě tohoto proteinu využita rekombinantní technologie. Na základě známé sekvence pseudoazurinu byly vytvořeny primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), které obsahují rozpoznávací místa pro vhodné restrikční endonukleasy Bam H1 a EcoR1. S pomocí těchto primerů, a s použitím chromozomální DNA bakterie Paracoccus denitrificans jako templátu byla v PCR, optimalizované pro syntézu dlouhých řetězců, amplifikována cDNA genu kódujícího pseudoazurin. Takto připravená DNA byla spojena s oligohistidinovou doménou a klonována do bakteriálního expresního systému. Bakteriální expresí byl vytvořen rekombinantní pseudoazurin, který byl následně purifikován s použitím chromatografie na matrici s vázanými ionty kovů. Schopnost transportu elektronů rekombinantně připraveného proteinu byla nejprve porovnána s aktivitou odpovídajícího proteinu vyizolovaného z divokého kmene Paracoccus denitrificans. Systém přenosu elektronů mezi dvěma typy respiračního řetězce byl charakterizován experimentálně na základě navrženého kinetického modelu. Nitritreduktasa byla vyizolována z divokého kmene Paracoccus denitrificans. |