Informace o publikaci
VYUŽITÍ REALTIME SYSTÉMU PRO KVANTIFIKACI RNA A JEHO POUŽITÍ V MOLEKULÁRNÍ PSYCHIATRII
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2006 |
| Druh | Článek v odborném periodiku |
| Časopis / Zdroj | Psychiatrie |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Neurologie, neurochirurgie, neurovědy |
| Klíčová slova | RealTime PCR molecular psychiatry quantification |
| Popis | Z dostupných metod molekulární biologie jsme pro studie mechanismů účinku stresu na transkripci vybraných genů zvolili metodu RealTime PCR, která umožňuje kvantifikaci mRNA. Zkoumané geny byly vybírány na základě znalosti molekulární podstaty regulací neurálních systémů, které se mění v důsledku působení stresu, a které se podílejí na kognitivních funkcích a chování. Pro naše studie jsme připravili metodiky RealTime PCR kvantifikace mRNA genů pro oxytocin, CRH (corticotropin-releasing factor), CREB (cAMP response element-binding protein) a GADPH (housekeeping gene - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenace). Tzv. TaqMan sondy specifické pro tyto mRNA byly designovány v programu PrimerExpress ze sekvencí volně dostupných v databázi GeneBank. Kritickým bodem v laboratorním postupu se ukázala izolace mRNA. Z několika možných postupů jsme vybrali izolaci čisté mRNA pomocí paramagnetických částic s vázaným polyT (kit chemagic Direct mRNA, chemagen). Jako standard (housekeeping gene), ke kterému jsme vztahovali výsledky amplifikace mRNA pro oxytocin, CRH a CREB jsme zvolili GADPH, u něhož je koncentrace mRNA v nervových buňkách uváděna jako nezávislá a konstantní. První výsledky ukázaly, že se podařilo zavézt vhodný systém kvantifikace vzhledem k tomu, že účinnost řetězové polymerázové reakce se jeví jako konstantní mezi metodikami pro jednotlivé geny, což je základním předpokladem pro možnost výpočtu relativní kvantity mRNA zkoumaných genů. Nově zavedené metodiky položily základ pro jejich použití při studiích vlivu různých faktorů na genovou transkripci. Metoda kvantifikace mRNA pomocí RealTime PCR obecně najde své použití v řadě oblastí a rozšíří výsledky a závěry studií, které byly již dříve získány jinými metodami, např. microarrays. |