Informace o publikaci
Vyuziti avidin-biotinove technologie pro studium hybridizace nukleovych kyselin
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2006 |
| Druh | Článek v odborném periodiku |
| Časopis / Zdroj | Časopis lékařů českých |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Elektrochemie |
| Klíčová slova | Carbon paste electrode; Biosenzor; DNA; modification; oxidation signals; |
| Popis | Uhlíková pastová elektroda představuje velmi vhodný prostředek pro konstrukci DNA biosenzorů. Uhlíkovou pastovou elektrodu je možné modifikovat inkorporací proteinů nebo enzymů přímo do uhlíkového prášku. V našich experimentech byla elektroda modifikována avidinem anebo streptavidinem. Elektrochemická analýza byla provedena velmi senzitivní SWV (Square-wave voltammetric analysis). Modifikovaná elektroda poskytuje oxidační signály tyrosinu (0,78 V) a tryptofanu (0,92 V) a je jí možné využít pro specifikou vazbu biotinylovaná DNA. Při navrhování konstrukcí senzorů těchto typů je hlavním problémem nespecifická interakce bází nukleových kyselin s povrchem elektrody. V našich experimentech jsme navrhli speciální postup. Na povrch modifikované elektrody byla nejprve navázána biotinylovaná DNA (čas interakce byl 2 min.). Po této době byla elektroda omyta v destilované vodě a 80% ethanolu. Je známo, že vazba mezi avidinem/streptavidinem a biotinem je velmi pevná. Z tohoto důvodu námi použitá procedura snadno odstranila DNA, která nebyla pevně navázána. Na takto připraveném DNA senzoru jsme nejdříve studovali jednořetězcové molekuly biotinylované DNA. Pozorovali jsme tři typy signálů, které se vzájemně doplňovaly, a to signál: adeninu, guaninu a steptavidinu. Pokles signálu streptavidinu ukazuje na vazbu biotinylované DNA na povrch elektrody. Signály adeninu a guaninu byly využity pro sestrojení kalibrační závislosti. V dalších našich experimentech jsme studovali změny signálů (adenin, guanin a streptavidin) v průběhu hybridizace. Z literatury je známo, že tento proces je charakterizován velmi malou změnou ve výšce signálů a často je naprosto nezbytné využít separačních technik (např. magnetické kuličky apod.). Pro ověření účinnosti naší metody jsme nejdříve připravili dsDNA přímo v roztoku. Biotinylovaná DNA (100 ľg/mL) byla smíchána se 100 ľg/mL komplementární DNA v 50 mM fosfátovém pufru (pH 7,0; 0,3 mM NaCl). Roztoky byly zahřívány (Thermomixer, Eppendorf) na 80C a následně pozvolna chladly asi (1 h). Pomocí našeho postupu jsme porovnali signály jednořetězcové biotinylované DNA a vzniklého hybridu DNA. Ze získaných výsledků byl patrný jasný rozdíl mezi pozorovanými signály. Proto jsme provedli obdobný experiment přímo v roztoku za využití modifikované elektrody. Sledovali jsme vliv času hybridizace na sledované signály. Podařilo se nám pozorovat pokles signálu o více než 30%. Navíc byl studován vliv nekomplementární DNA. V přítomnosti nekomplementární DNA bylo pozorováno asi 20% ovlivnění sledovaných signálů detekované DNA. Navržená technologie je dále rozvíjena o nový přístup umožňující analýzu obsahu všech bází nukleových kyselin na povrchu uhlíkové elektrody. |
| Související projekty: |