Všechny aspekty buněčné fyziologie jsou ovlivňovány signálními drahami. Jednou z nich je i Wnt signalizace, která se podílí na procesech jako embryonální vývoj, zachování homeostázy organismu anebo řízení kmenovosti.
Protein Dishevelled (DVL) je klíčová komponenta Wnt signalizace, která funguje jako přepínač mezi jednotlivými Wnt drahami. DVL se skládá ze tří strukturovaných domén (DIX, PDZ a DEP), které jsou spojeny vnitřně neuspořádanými regiony. Přestože DVL je intenzivně studován a struktura všech tří individuálních domén je již vyřešená, dosud chybí informace o celé molekule a její konformační dynamice v nativním podmínkách. Pro tyto účely jsme vytvořili několik FRET (Försterův rezonanční přenos energie) sensorů – variant DVL3, do kterých jsme na různá místa vklonovali 6 aminokyselin dlouhé značky (tzv. “FlAsH tagy”), které nám umožňují spolu s ECFP značkou studovat přístupem FRET konformační dynamiku DVL3 v buněčné linii HEK293 in vivo. Za použití těchto sensorů jsme studovali konformační dynamiku proteinu DVL3 a objevili jsme, že Kasein kináza 1 epsilon (CK1e) hraje důležitou funkci ve vytváření tzv. otevřených a zavřených konformací DVL3, které jsou zprostředkované doménou PDZ a C-konce proteinu. Dále jsme pomocí in vitro a in silico technik ukázali na atomární úrovni, jak fosforylace v PDZ doméně, které jsou indukované kinázou CK1e, regulují otevřené a uzavřené konformace DVL3. Naše práce jako první implementuje nástroj pro studium konformace proteinu DVL3 v živých buňkách a uplatňuje ho při studiu regulace postranslačními modifikacemi (PTM) proteinu DVL3.
Tento projekt (tj. manuskript, který je součástí přílohy) již prošel prvním kolem recenzního řízení v prestižním časopise Nature Communications (IF ≈ 12) a vyřešení bodů a)-d) (viz níže), které byly navrženy reviewery, se jeví jako nezbytné k úspěšnému publikování našich výsledků. Projekt GAMU bude použit k vyřešení následujících dílčích otázek: a) jaký vliv mají otevřené/zavřené konformace na vazbu DVL3 na buněnčnou membránu k receptoru Frizzled, b) jak mění konformaci Dvl aktivace dráhy Wnt ligandem, c) jak otevřených/zavřených konformací DVL3 korelují se sub-buněčnou lokalizací proteinu DVL, a d) provést analýzu rekombinantního FRET sensoru ECFP-DVL3 FIII také in vitro.

Publications