Pokročilé metody v současné genomice a proteomice

Pokročilé metody analýzy proteinových komplexů

Proteinové databáze a co v nich dnes najdete (od sekvence po strukturu a funkci). Jak vypadají a k čemu jsou proteinové komplexy? Moderní metody analýzy proteinových komplexů. Jak si namodelovat proteiny a jejich komplexy – co (ne)dokáže AlphaFold.

Nové trendy v proteomice pomocí hmotnostní spektrometrie

Proteomika jako vědní disciplína zásadním způsobem přispívá k porozumění molekulární podstaty života. A to zejména díky rozvoji hmotnostní spektrometrie, která v kombinaci s vhodnými separačními technikami umožňuje paralelní kvalitativní a kvantitativní charakterizaci desítek tisíc proteinů a jejich modifikovaných forem, resp. charakterizaci proteinových interakcí. V přednášce budou nastíněny současné možnosti studia proteinů, jednotlivé metodické možnosti a budou uvedeny příklady proteomických aplikací.

Pokročilé fluorescenční metody při detekci, analýze a vizualizaci biomolekul

Interaktivní multimediální přednáška zaměřená na vysvětlení teoretických principů a představení možností praktického použití fluorescenčních metod a jejich kombinací při sledování proteinů a nukleových kyselin.

Odpovíme si mimo jiné společně na otázky:

• Jaké metody využívají detekce proteinů na základě vnitřní fluorescence aminokyselin?
• Proč a jak se používá kombinace fluorescenčního přenosu energie a časově rozlišené fluorescence pro validaci přímé vazby biomolekul?
• Které fluorescenční značky a sondy jsou vhodné pro kvantitativní analýzu přítomnosti proteinů a DNA a s jakou citlivostí?

Metody sekvenování DNA a RNA

Princip Sangerovy terminační metody sekvenování DNA. Příprava vzorku k sekvenování a varianty provedení. Jak byl poprvé sekvenován lidský genom (strategie projektu HUGO). Strategie sekvenování genomu pšenice. Principy sekvenování pomocí přístupů nové generace (next generation) – především Illumina. Výhody a nevýhody. Principy sekvenování metodami třetí generace (PacBio-SMRT, Oxford Nanopore). Výhody a nevýhody. Přímé sekvenování RNA. Analýza genové exprese (transkriptomu).

Analýza epigenetických značek a struktury chromatinu

Metody analýzy metylace DNA, metody analýzy posttranslačních modifikací histonů a histonových variant spojená s lokalizací v genomu (ChIP-Seq, imunodetekce in situ), analýza polohy nukleozomů (MNase-Seq, ATAC-Seq), analýza organizace chromatinu vyššího řádu (Hi-C). Epitranskriptomické modifikace, jejich význam (např. regulace odolnosti RNA k odbourávání, trvanlivost transkriptů z X/Y chromozomů) a metody analýzy.

qPCR – princip, moderní přístupy, aplikace, především v klinice

Princip a provedení (sekvenčně specifická a sekvenčně nespecifická qPCR, varianty sekvenčně specifické qPCR, multiplex analýza, analýza bodu tání DNA). Design experimentu, optimalizace podmínek reakce, vyhodnocení (absolutní a relativní kvantifikace). Příklady použití (stanovení hladin transkriptů + srovnání s alternativními metodami, diagnostika včetně infekce SARS-Cov2, detekce GMO, detekce fytopatogenů).​

Epigenetika – o co jde, jak to funguje a co se stane, když to nefunguje

Epigenetika a epigenetické modifikace a mechanismy (methylace DNA, modifikace histonů, malé a nekódující RNA). Epigenetické modifikace a struktura chromatinu ve vztahu k regulaci genové exprese v různých modelových organismech. Klíčová role epigenetických regulací během ontogeneze, v reakci na změnu podmínek. Writers, readers, erasers – enzymy, které přidávají epigenetické modifikace, umějí je rozpoznávat, odstraňují je. Poruchy epigenetických regulačních mechanismů jako příčina závažných chorob (nemoci spojené s poruchou imprintingu, nádorová onemocnění, autoimunitní onemocnění, závislosti, …).

Analýza sekvenčních dat

Přehled typu sekvenčních dat (fastq, fasta, gff, bam atd.). První nahlížení do sekvenčních dat (bioedit, geneious, GALAXY, FASTQC). Základní nástroje pro analýzu sekvenčních dat (dot-plot, alignment, blast). Pokročilé metody zpracování sekvenčních dat (sestavování genomů a transkriptomů, identifikace repetic, mapování, diferenciální exprese genů). V nástinu NGS v klinické a forenzní praxi.

Příprava knihoven pro sekvenování nové (NGS) a třetí generace (TGS)

Jak lze přečíst cele genomy jako knihu, jak se taková genomová knihovna vlastně připravuje a z čeho se skládá? Obsahem lekce je (i) vysvětlení základních principů jednotlivých kroků přípravy knihoven pro sekvenování DNA a RNA (ii) seznámení se s přístrojovou instrumentací potřebnou pro přípravu knihoven a sekvenování (iii) praktické ukázky využití moderních metod sekvenování v diagnostice, analýze genové expresse, RNA/DNA-proteinových interakcí, epigenetických modifikací DNA a RNA či analýze sekundární struktury RNA.

Analýza genové exprese a nástroje systémové biologie

V přednášce bude popsána struktura genu včetně nejdůležitějších funkčních a regulačních oblastí. Budou prezentovány metody kvantitativní analýzy genové exprese (transkriptomové profilování pomocí DNA čipů a NGS) i metody pro určení časoprostorové specificity genové exprese pomocí experimentálních přístupů (příprava transkripční fúze promotoru studovaného genu nebo translační fúze kódující sekvence a reportérového genu) i pomocí vyhledávání ve veřejně dostupných databázích získaných pomocí analýzy transkriptomu na úrovni jednotlivých buněk. Budou také představeny základní přístupy systémové biologie (genová ontologie, Bayesovské sítě a matematické modelování regulačních genových sítí).

Metody extrakce, purifikace a kvantifikace nukleových kyselin

Izolace celkové DNA/RNA z různých typů tkání a pletiv; izolace specifických typů nukleových kyselin (NK) (např. mDNA, ctDNA, nekódující RNA) moderními metodami; izolace NK určené pro sekvenování nové generace (NGS, next-generation sequencing); ověřování čistoty NK a přesné měření velmi malých koncentrací NK; specifika práce s komerčně dostupnými kity na izolaci DNA/RNA z různých typů tkání; separace NK se zaměřením na gelové elektroforézy (agarózové, polyakrylamidové); principy a separační vlastnosti gelů; méně používané typy elfo (např. nízkotající a alkalické agarózy; denaturující či nedenaturujíci akrylamidové gely); možná úskalí a odstraňování problémů a interpretace výsledků.