Aktivácia STAT3 fosforyláciou na pozícií S727 v neurónoch lumbálnych aj cervikálnych spinálnych ganglií potkanov po poškodení nervus ischiadicus

• Autoři: KOKOŠOVÁ Viktória
• Rok publikování: 2017
• Druh: Další prezentace na konferencích
• Fakulta / Pracoviště MU: Lékařská fakulta
• Popis: Pre úspešnú regeneráciu poškodených axónov je nutné naštartovanie regeneračného programu neurónu, ktorý zahŕňa zmenu v syntéze a v axonálnom transporte mnohých proteínov. IL-6 je cytokín, ktorý sa viaže na receptorový komplex IL-6R/gp130. Aktivované Jak2 kinázy fosforylujú jeho cytoplazmatickú časť, kam sa napojí transkripčný faktor STAT3. STAT3 je tu fosforylovaný na tyrozíne 705 a následne je translokovaný do jadra, kde ovplyvňuje génovú expresiu s regeneráciou asociovaných génov (RAGs). STAT3 môže byť fosforylovaný tiež na seríne 727, ktorý môže zvýšiť, alebo aj znížiť transkripčnú aktivitu pSTAT3-Y705. K experimentom bolo použitých 16 potkanov línie Whistar (samci, 250–300g). Boli rozdelení do štyroch skupín. Všetky chirurgické zákroky boli vykonané za aseptických podmienok. U prvej skupiny potkanov (KNI, n=4) sme navodili kompresiu pravého nervus ischiadicus trojitou ligatúrou asi 1cm od jeho výstupu. V tejto úrovni bol druhej skupine (TNI, n=4) nerv preťatý, otočený a ligovaný o 180°, aby sa zabránilo spontánnej reinervácií. Tretia skupina podstúpila odhalenie nervu, ale bez poškodenia (sham-operácia). Potkani týchto troch skupín prežívali 7 dní (7D). Štvrtá skupina bez chirurgickej intervencie slúžila ako naivná kontrola. Po usmrtení vdychovaným CO2 boli zvieratá perfundované Zamboniho fi xačným roztokom a odobrané spinálne gangliá (SG) v úrovniach L4 a C6-C8 na ispi- (SGi) aj na kontralaterálnej (SGc) strane boli fi xované cez noc. Na longitudinálnych kryostatových rezoch hrúbky 12µm bol za rovnakých podmienok nepriamou imunohistochemickou metódou detekovaný pSTAT3-S727. Sekundárna protilátka bola značená tetramethyl-rhodamin-isothiocyanatom (TRITC) a jadrá boli vizualizované farbením Hoechst 33342. Rezy boli nasnímané vo fl uorescenčnom mikroskope Nikon Eclipse NI-E vybavenom kamerou Nikon DS-Ri1 za rovnakých podmienok. Analýzou obrazu v programe NIS Elements (Nikon) sme merali intenzitu imunofl uorescencie (IF) pSTAT3-S727 v jadrách neurónov, ktoré sme rozdelili do skupín podľa veľkosti: malé (<25µm), stredné (25-40µm) a veľké (>40µm). V jadrách neurónov cervikálnych i lumbálnych SG u kontrolných zvierat bola nameraná nízka intenzita IF pre pSTAT3-S727. Medzi naivnými a sham-operovanými zvieratami nebol zistený signifi kantný rozdiel v nameranej intenzite IF. V SG segementu L4 u skupín TNI a KNI bola intenzita IF signifi kantne zvýšená na ipsi- aj na kontralaterálnej strane. V oboch experimentálnych skupinách nie všetky neuróny SG lumbálnych segmentov vykazovali translokáciu pSTAT3-S727. Jadrá veľkých a stredných neurónov mali heterogénne rozloženie IF, na rozdiel od neurónov malej veľkosti, u ktorých bolo rozloženie IF homogénne. K zvýšeniu IF aktivovaného pSTAT3-S727 došlo po unilaterálnom TNI a KNI nielen v neurónoch SG na úrovni segmentu L4, ale i bilaterálne na úrovni segmentov C6-C8. Na rozdiel od SG lumbálnych segmentov bola translokácia pSTAT3-S727 takmer u všetkých neurónov SG C6-C8 segmentov, čo naznačuje iný spôsob aktivácie STAT3, než priamym poškodením axónov. Aktivácia STAT3 na pozícií Y705 je považovaná za molekulárny znak naštartovania regeneračného programu neurónov. Dokázali sme, že po poškodení periférneho nervu dochádza tiež k fosforylácií STAT3 na pozícií S727 a jeho translokácií do jadier neurónov, a to v SG nielen lumbálnych, ale aj vo vzdialených cervikálnych segmentoch. Naše prioritné zistenie aktivácie STAT3 na pozícií S727 v neurónoch SG koreluje so skôr zisteným zvýšením IL-6, IL-6R a pSTAT3-Y705 v SG lumbálnych i cervikálnych segmentoch po poškodení nervus ischiadicus. To podporuje koncepciu šírenia zápalovej signalizácie subarachnoideálnym priestorom pozdĺž miechy, ktorý vytvára systémovú reakciu SG na poškodenie periférneho nervu.