Zvýšená expresia chemokínu CCL2 a reštart regeneračného programu v neurónoch lumbálnych aj cervikálnych spinálnych ganglií po poškodení sedacieho nervu

• Autoři: KOKOŠOVÁ Viktória
• Rok publikování: 2018
• Druh: Další prezentace na konferencích
• Fakulta / Pracoviště MU: Lékařská fakulta
• Popis: Úvod: CCL2 je významnou molekulou, ktorá má vplyv na regeneračnú kapacitu poškodeného neurónu. Tento chemokín spôsobuje extravazáciu makrofágov do miesta poškodenia, alebo prebiehajúceho zápalu. Pôsobí najmä cez receptor CCR2, čo je s G-proteínom asociovaný receptor. Aktivácia tohto receptoru vedie v neurónoch spinálnych ganglií (SG) k zvýšenej expresii LIF, čo je cytokín pôsobiaci cez receptor gp130. Pôsobením LIF cez receptor gp130 dochádza k aktivácií transkripčného faktoru STAT3, ktorý je nevyhnutný pre úspešný reštart regeneračného programu poškodeného neurónu. Na druhej strane však CCL2 spôsobuje i hyperexcitabilitu neurónov a tým vytvára podkklad pre rozvoj neuropatickej bolesti. Metody: K experimentom boli použité potkany línie Whistar (samci, 250-300g). Všetky chirurgické zákroky boli vykonané za aseptických podmienok. Kompresiu pravého nervus ischiadicus sme navodili trojitou ligatúrou asi 1cm od jeho výstupu (KNI). Potkani prežívali 7 dní (7D). Skupina bez chirurgickej intervencie slúžila ako naivná kontrola (naive). Po usmrtení vdychovaným CO2 boli zvieratá perfundované Zamboniho fixačným roztokom a odobrané spinálne gangliá (SG) v úrovniach L4 a C7 na ispi- (SGi) aj na kontralaterálnej (SGc) strane boli fixované cez noc. Na longitudinálnych kryostatových rezoch o hrúbke 12µm bol za rovnakých podmienok nepriamou imunohistochemickou metódou detekovaný CCL2 a GAP43. Sekundárna protilátka bola v reakcii pre vizualizáciu GAP43 aj pre vizualizáciu CCL2 značená fluorescein-isothiokyanátom (FITC). K detekcii aktivovaných makrofácgov sme použili primárnu protilátku proti epitopu ED1, pričom sekundárna protilátka bola značená tetramethyl-rodamin- -isothiocyanatom (TRITC). Jadrá boli vizualizované farbením Hoechst 33342. Rezy boli nasnímané vo fluorescenčnom mikroskope Nikon Eclipse NI-E vybavenom kamerou Nikon DS-Ri1 za rovnakých podmienok. Analýzou obrazu v programe NIS Elements (Nikon) sme merali intenzitu imunofluorescencie (IF) CCL2 a GAP43 v neurónoch SG, ktoré sme rozdelili do skupín podľa veľkosti: malé (<25µm), stredné (25-40µm) a veľké (>40µm), a proporciu ED1+ pixelov k proporcii plochy obsahujúcej neuróny. Výsledky: Po unilaterálnej kompresii nervus ischiadicus (NI) dochádza k zvýšenej expresii CCL2 v neurónoch SG nielen v odpovedajúcich lumbálnych segmentoch, ale aj v cervikálnych segmentoch. K zvýšeniu intezity IF CCL2 došlo vo veľkých neurónoch len na ipsilaterálnej strane k poškodenému nervu, zatiaľ čo v populácií stredne veľkých a malých neurónov došlo k tomuto zvýšeniu bilaterálne. Po rovnakej dobe unilaterálnej kompresie NI bolo zistené zvýšené množstvo aktivovaných makrofágov opäť nielen v SG lumbálnych segmentov, ale aj v cervikálnych segmentoch. Rovnako bola signifikantne zvýšená intenzita IF GAP43 u zvierat po kompresii nervus ischiadicus v lumbálnych aj cervikálnych SG na ipsi- aj na kontralaterálnej strane. Závěr: Výsledky našich experimentov naznačujú, že v kontralaterálnych SG a to v lumbálnych aj cervikálnych segmentoch je populácia stredne veľkých a malých neurónov významným zdrojom chemokínu CCL2, ktorý zohráva úlohu pri stimulácií invázie aktivovaných makrofágov. Z publikovaných prác je známe, že makrofágy sa môžu podielať na aktivácií regeneračného programu neurónu SG. Týmto záverom odpovedá naše zistenie zvýšenej hladiny proteínu GAP43, ktorý slúži ako marker aktivácie regeneračného programu neurónov.