Bioluminiscence je proces emise studeného světla s původem v živých organismech, jehož uplatnění v biotechnologických a biomedicínských oborech čím dál více nabývá na důležitosti. Bioluminiscenční reakce jsou například běžně využívány při stanovení biomolekul a iontů, při sekvenování DNA nebo jako klíčová součást zobrazovacích metod pro monitorování genové exprese v rámci jednotlivých buněk a tkání, sledování průběhu infekcí, růstu nádorů a tvorby metastáz a mnohých dalších fyziologických nebo patologických procesů. Jedním z nejvyužívanějších a nejdéle studovaných bioluminiscenčních enzymů je luciferáza z organismu Renilla reniformis (RLuc). Tento enzym in vitro katalyzuje monooxygenaci energeticky bohatého substrátu, koelenterazinu (CTZ), za vzniku dioxethanonového meziproduktu, po jehož následné dekarboxylaci dochází k emisi fotonu viditelného modrého světla. Různé varianty genového reportéru odvozeného od luciferázy RLuc jsou komerčně dostupné, a používají se široce v biomedicínských a biotechnologických laboratořích. Nicméně, hlavní nevýhodou enzymu RLuc je jeho nízká stabilita. Enzym špatně odolává teplotám nad 35 °C a i při skladování při 4 °C dochází nejspíše vlivem agregace k významným koncentračně závislým ztrátám specifické aktivity. K významné inaktivaci enzymu dochází také při jeho kontaktu se substrátem. Jedna molekula RLuc je in vitro schopná katalyzovat přeměnu jen asi 100 molekul koelenterazinu, načež dochází k nevratné ztrátě luciferázové aktivity enzymu; princip tohoto inaktivačního děje není doposud znám. Následkem kombinace vysoké aktivity RLuc se substrátem indukovanou inaktivací tento enzym vytváří bioluminiscenci tzv. zábleskového typu (angl. flash-type), která je charakteristická vysokou intenzitou na počátku reakce následovanou jejím rychlým útlumem. V našem výzkumu jsme se zaměřili na odstranění právě těchto nevýhod RLuc enzymu. Přes rekonstrukci domnělého předka dnešních luciferáz a jeho následného inženýrství jsme byli schopni identifikovat proteinové elementy, které hrají klíčovou roli v evoluci luciferázové reakce. Výsledkem naší práce pak byla konstrukce nových typů syntetických luciferáz, které postrádají nevýhody luciferázy RLuc divokého typu, a krom toho vykazují výrazně zvýšenou afinitu k substrátu (koelenterazin) a generují bioluminiscenci tzv. zářivého typu (angl. glow-type) se stabilním dlouhotrvajícím signálem.

Sustainable Development Goals

Masaryk University is committed to the UN Sustainable Development Goals, which aim to improve the conditions and quality of life on our planet by 2030.