Informace o publikaci

Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů

Logo poskytovatele
Logo poskytovatele
Autoři

ZEISBERGEROVÁ Marta KLIMÍČKOVÁ Andrea GLATZ Zdeněk

Rok publikování 2008
Druh Článek ve sborníku
Konference XXI. biochemický sjezd ČSBMB a SSBMB
Fakulta / Pracoviště MU

Přírodovědecká fakulta

Citace
Obor Biochemie
Klíčová slova kapilární elektroforéza; EMMA; proteomika
Popis Proteomika je rychle se rozvíjející oblast biochemického výzkumu, jejíž hlavní náplní je charakterizace komplexních směsi proteinů extrahovaných z buněk či tkání. Dominantní metodou je zde dvojrozměrná elektroforéza 2D-PAGE. Přestože je schopna rozseparovat tisíce proteinů během jediné analýzy, má vážná omezení, jde o metodu pracnou a časově náročnou, nelze opomenout i limitovanou citlivost a dynamický rozsah. Proto jsou hledány jiné metody vyznačující se vysokou separační účinnosti, a především možností přímé kombinace s tryptickým štěpením a detekcí pomocí MS. Jako jedna z variant se také nabízí kapilární elektroforéza (CE), především pak její modifikace elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA). Ta se vyznačuje plnou automatizací kombinovanou s velmi malou spotřebou vzorku, což je dáno tím, že EMMA využívá kapiláru nejenom jako separační medium, ale také jako reakční prostor. Cílem této práce bylo využít metodu EMMA pro on-line tryptické štěpení proteinů pro proteomický výzkum s předpokládaným spojením s detekcí pomocí MS. Vzhledem ke skutečnosti že pH optimum trypsinové reakce se liší od optimálního pH používaného v CE pro separaci peptidů, byla zde použita kombinace metody EMMA s technikou částečného plnění kapiláry. V tomto uspořádání je ta část kapiláry kde probíhá tryptické štěpení naplněna pufrem optimálním pro tuto reakci (Tris-HCl pufr pH 8.5), kdežto zbytek kapiláry základním elektrolytem optimálním pro separaci peptidů (0.1 M fosfátový pufr pH 2.5). Jelikož se proteiny liší svými pI a tím i efektivní mobilitou, bylo použito sendvičové dávkování, při kterém je vzorek proteinu nadávkován mezi dvě zóny trypsinu, což zaručuje jejich promíchání a tím i digesci. Analýza jednoho proteinu včetně digesce a separace vzniklých peptidů tak trvá jednu hodinu, což je značné zkrácení oproti klasické digesci v roztoku.
Související projekty:

Používáte starou verzi internetového prohlížeče. Doporučujeme aktualizovat Váš prohlížeč na nejnovější verzi.

Další info